Cell | 钾选择性视紫红质的“精挑细选”：解锁离子选择性的结构基础

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光是一种重要的能量来源和环境信号，运动型生物利用视紫红质家族蛋白来感知光。视紫红质分为微生物型和动物型，都包含一个七螺旋跨膜结构域（视蛋白），与一个色素（视黄醛）共价结合¹。微生物视紫红质在吸收光时发生视黄醛异构化，激活多种离子泵、离子通道、传感器和酶发挥功能。当通过遗传学方法将外源光敏感蛋白靶向导入特定活细胞，利用特定波长的光照刺激光敏蛋白，就能以高时空分辨率控制动物体内特定细胞的膜电位。光遗传学已应用于神经回路和有机体生理学的研究以及人类疾病的治疗²。

光遗传学技术即通过光来激活或抑制神经元活动的目标。其中，激活或抑制的原理在于不同通道对阳离子或阴离子的通透：如果转入细胞的是阳离子传导通道视紫红质 (ChR)，那么在细胞被光照激活时，阳离子内流，产生去极化电位，诱发动作电位的发出，激活细胞；如果转入细胞的是阴离子传导通道视紫红质 (ACR)，细胞接受光照时阴离子内流，产生超极化电位，导致动作电位不易发放，抑制细胞活动。

然而，发育或解剖上的Cl^- 梯度变化可能导致非预期的神经元兴奋，使一些ACR应用复杂化。由于复极化引起的生理性神经元膜失活涉及 K⁺ 外排，因此可以考虑创建 K⁺ 选择性ChRs来实现神经元沉默³。然而，先前已知的 K⁺ 通道表现出保守的组织，与ChRs没有相似性。

已经确定了两种微生物视紫红蛋白作为光门控的K⁺选择性通道⁴。这些来自链胞菌的KCR视紫红蛋白（HcKCR1和HcKCR2）与先前发现的PLCRs具有相同的序列同源性，但其 K⁺ / Na⁺ 渗透比却超过了其他PLCRs、CCR和一些经典的 K⁺ 通道。因此，KCRs显示出作为抑制性光遗传学工具的潜力。然而，KCRs的 K⁺ 选择性机制仍然不清楚，这项研究不仅可以作为理解离子通道蛋白如何实现 K⁺ 选择性的一般范例，而且还有助于开发下一代基于KCR的光遗传学工具。

2023年8月31日，东京大学Hideaki E. Kato实验室与斯坦福大学Karl Deisseroth实验室合作，在Cell期刊上发表了题为Structural basis for ion selectivity in potassium-selective channelrhodopsins的论文。研究者以2.5-2.7 Å分辨率解析了HcKCR1和HcKCR2，以及一个具有增强 K⁺ 选择性突变体的冷冻电镜结构。结构及生化分析揭示了一种独特的 K⁺ 选择性机制，为体外和体内的光遗传学抑制提供了关键优势。此外，离子通道 K⁺ 选择性的发现也为下一代光遗传学提供了一个框架。

研究者将HcKCR1、HcKCR2重组为脂质纳米圆盘，得到了2.6 Å和2.5 Å的冷冻电镜结构。HcKCR1和HcKCR2都形成三聚体，三聚化是通过相邻单体的跨膜螺旋1-2和4-5之间的脂质直接介导的相互作用（图1A和1B）。这些单体具有胞外N端区域，胞内C端区域和7个跨膜螺旋结构域，由三个胞内环 (ICL1-3) 和三个胞外环 (ECL1-3) 连接（图1C和1D）。HcKCR1和HcKCR2的整体结构几乎相同，仅在N端区、ICL和ECL上存在微小差异（图1E）。

图 1 HcKCR1、HcKCR2的冷冻电镜结构

微生物视紫红质中，有一个全反式视黄醛分子通过Schiff碱与保守的TM7赖氨酸共价结合。这个区域的结构影响着微生物视紫红质感知光并接受质子的关键性质。通过对结构分析发现，HcKCRs在Schiff碱质子和两个天冬氨酸（D105和D229）之间没有观察到水分子（图2A）。这些差异促使进一步表征D105和D229。研究者进行了一系列实验分析HcKCRs的野生型、D105N和D229N突变体的差异。结果表明，在暗态下，D105和D229都是去质子化的，只有D229作为主要的反离子来稳定Schiff碱基质子的正电荷。这一点与ChRmine相反，在ChRmine中，D115和D253都是Schiff碱基质子的必需反离子。

图 2 Schiff碱区域

环绕视蛋白发色团的残基对关键的光控离子通道特性至关重要，包括动力学和吸收光谱。研究者发现HcKCRs和ChRmine在视黄醛结合口袋中共享高度相似的残基（图3A、B）。研究者构建了_HcKCRs中Y106、T109 、C110和V133的突变体，结果表明，C110T突变使HcKCR1和2的τ_off分别增加了约1500倍和约1800倍（图3D）；值得注意的是，HcKCR1 C110T保留了相当的光电流大小（图3C）。因此，这项研究提供了任何PLCR的初始步进函数蛋白，HcKCR1 C110T显示出作为长时间抑制的光遗传工具的潜力。此外，研究者还观察到， HcKCR2中的A136/A140与C17原子产生位阻，并同时为C16原子提供空间，从而诱导β-离子酮环的旋转（图3E），因此，HcKCR2代表了最初自然产生的微生物视紫红质，具有实验证明的6-s-顺式视黄醛结构（图3F）。

图 3 视黄醛结合口袋

虽然三个主要的ChR都是由多聚体组装而成，但每个单体内都有由TM1、2、3和7形成的离子通道。与ChRmine相比，HcKCRs存在三个显著的结构差异：(1) CCS的相互作用网络不同；(2) HcKCRs中的EV延伸到核心束的更深处，达到Schiff碱基；(3) ChRmine中EV中的几个亲水残基被芳香残基替代，使表面更加疏水（图4）。

图 4 离子传递通道

为了理解 K⁺ 选择性的机制，研究者对HcKCR1的IVs和EVs中的残基进行了突变，并在生理离子梯度条件下测量了反向电位。与先前的研究结果一致，表明其作为一种选择性 K⁺ 通道，具有轻微的 Na⁺ 导电性。有趣的是，突变体F221A、H225F、H225A和H225Y显示出更高的 K⁺ 选择性；相反，N99L、W102Q和Y222A突变体对 Na⁺/K⁺ 几乎不具有选择性。这五个残基定位在EV中，可能会组装并形成一个选择性过滤器（图5A、B）。

在典型的 K⁺ 通道中，离子选择性过滤器通常由 K⁺ 占据。然而在这里的KCR结构中，研究者没有发现 K⁺ ，并证实K⁺ 在暗态下不稳定地结合到KCR中。此外，研究者进一步发现，离子在N99、W102和Y222之间通过，并将其称为选择性三联体，然后以最小的蛋白质畸变进入细胞外腔（图5C、D）。

相比之下， H225突变体中 K⁺ 选择性显著增强的原因仍不清楚。为了解决这个问题，研究者解析了H225F突变体的冷冻电镜结构，分辨率为2.7 Å，观察到EV中没有显著差异。之后，研究者又对WT和H225F进行了分子动力学模拟，结果表明，HcKCR1中的选择性三联体具有固有的灵活性，而H225的突变稳定了有利于 K⁺ 选择性的结构（图5E、F）。

图 5  K⁺ 选择性过滤器

接下来，研究者在两种不同的双离子条件下进行了电生理实验。当测量HcKCR1和HcKCR2中的Erev时，发现在保持强大的光电流的同时，Erev正向移动，在反向条件下，表明当浓度梯度反转时P_K/P_Na减少（图6A）。此外，对HcKCR1存在 K⁺ 的情况下进行分子动力学模拟，观察到 K⁺ 在IV附近的瞬时结合，IV由D116和T120的狭窄部位定义（图6B-D）。研究者进一步通过分析胍基离子 (Gu⁺) 对HcKCR1活性的影响来研究脱水的重要性（图6E、6F）。胞内Gu⁺的添加完全阻断了WT HcKCR1的通道活性, 推测是因为无法再与D116结合，就像R244的胍基团一样。（图6F）。

图 6 渗透脱水的计算与功能分析

值得注意的是，来自细胞内侧的一价阳离子可能会经历逐渐脱水，当达到选择性三联体时，水分的数量减少。无论离子流的方向如何，部分脱水的 K⁺ 与三联体之间的相互作用更有助于降低能量屏障，解释了选择性的 K⁺ 渗透（图6G）。当梯度被倒转时，来自细胞内侧的 Na⁺ 成为主要的离子，在到达过滤器之前部分脱水。因此，梯度提供的自由能可以弥补次优的Na⁺-三联体相互作用（图6H）。值得注意的是，选择性三联体的结构是动态的。当Y222远离W102时，结构发生变形，离子的能量屏障降低，导致选择性的暂时降低。围绕过滤器的残基突变（例如F221或H225）可以通过稳定过滤器区域来增强 K⁺ 选择性（图6I）。

KCRs有潜力成为神经科学的有效抑制光遗传学工具。因此，研究者旨在利用对增强 K⁺ 选择性的结构理解，为体外和体内应用设计改进的抑制性光遗传学工具。与WT相比，H225F突变体表现出超极化的Erev（图7A），在培养的神经元中只有轻微的光电流下降（图7B）和相似的动力学（图7C）。有趣的是，在单光子和双光子照射下，H225F的作用光谱显示出蓝光和红光的减少（图7D）。由于这些有效的功能丧失特性，研究者将HcKCR1和HcKCR2的H225F突变体命名为KALI-1和KALI-2 (K⁺-selectivity Augmented Light-Gated Ion Channels)。总之，KALIs在不同的实验中为抑制光遗传学提供了实质性的优势，包括两种最强大的现代方法：完整神经回路的全光生理学和体内神经活动的高密度记录（图7）。

图 7 KALI-1在体外和体内的应用

综上所述，KCRs采用了一种独特的机制，以在生理离子平衡条件下特异性地促进 K⁺ 通量。该机制依赖于三个关键因素，包括（1）细胞外选择性过滤器，（2）细胞内脱水系统，以及（3）在生理条件下存在的高浓度细胞外 Na⁺ 和细胞内 K⁺ 。在这里，研究者揭示了这些特殊特性的初始结构和机制基础，深入了解了微生物蓝光受体中 K⁺ 选择性的出现，并提供了结构引导的修饰方法，设计了相应的具有增强 K⁺ 选择性的KCR变体，在体外和体内的光遗传学抑制中提供了关键优势。离子通道 K⁺ 选择性机制的发现也为下一代光遗传学提供了一个框架。

原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00863-2

参考文献

参考文献

[1] Zhang F. Vierock J. Yizhar O. Fenno L.E. Tsunoda S. Kianianmomeni A. Prigge M. Berndt A. Cushman J. Polle J. et al. The Microbial Opsin Family of Optogenetic Tools. Cell. 2011; 147: 1446-1457

[2] Emiliani V. Entcheva E. Hedrich R. Hegemann P. Konrad K.R. Lüscher C. Mahn M. Pan Z.H. Sims R.R. Vierock J. Yizhar O. Optogenetics for light control of biological systems. Nat. Rev. Methods Primers. 2022; 2: 55

[3] Emiliani V. Entcheva E. Hedrich R. Hegemann P. Konrad K.R. Lüscher C. Mahn M. Pan Z.H. Sims R.R. Vierock J. Yizhar O. Optogenetics for light control of biological systems. Nat. Rev. Methods Primers. 2022; 2: 55

[4] Govorunova E.G. Gou Y. Sineshchekov O.A. Li H. Lu X. Wang Y. Brown L.S. St-Pierre F. Xue M. Spudich J.L. Kalium channelrhodopsins are natural light-gated potassium channels that mediate optogenetic inhibition. Nat. Neurosci. 2022; 25: 967-974

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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THE END

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